在生物制藥領(lǐng)域，單細(xì)胞克隆篩選是藥物研發(fā)的關(guān)鍵步驟之一。FujiFilm Diosynth Biotechnologies公司是一家專注于生物制藥研發(fā)的公司，他們面臨著快速產(chǎn)生高產(chǎn)單細(xì)胞克隆的挑戰(zhàn)。為了應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)，FujiFilm Diosynth Biotechnologies采用了Cell Metric高分辨率孔板成像系統(tǒng)，開發(fā)了一種快速產(chǎn)生高產(chǎn)單細(xì)胞克隆并保證高概率和高單克隆源性的新工作流程。本文將詳細(xì)介紹使用Cell Metric高分辨率孔板成像系統(tǒng)進(jìn)行單細(xì)胞克隆篩選的相關(guān)工藝開發(fā)流程：

 1. 單細(xì)胞包裹到油基微滴中

這一步驟的實(shí)施主要是通過(guò)將細(xì)胞與油基微滴混合，使細(xì)胞均勻分布在微滴中。油基微滴的大小通常在幾百微米左右，這樣可以確保每個(gè)微滴中只包含一個(gè)細(xì)胞。將單細(xì)胞包裹到油基微滴中后，細(xì)胞會(huì)在微滴中生長(zhǎng)，并表達(dá)感興趣的基因。

2. 基于FRET信號(hào)分選高產(chǎn)克隆

基于FRET信號(hào)分選高產(chǎn)克隆是利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）技術(shù)來(lái)篩選高產(chǎn)克隆。FRET是一種熒光信號(hào)的傳遞方式，當(dāng)兩個(gè)熒光團(tuán)距離足夠近時(shí)，能量可以從發(fā)射能量高的熒光團(tuán)轉(zhuǎn)移到發(fā)射能量低的熒光團(tuán)。在單細(xì)胞克隆篩選中，通常將一個(gè)熒光團(tuán)標(biāo)記在感興趣的基因上，另一個(gè)熒光團(tuán)標(biāo)記在細(xì)胞的表面或內(nèi)部。當(dāng)兩個(gè)熒光團(tuán)距離足夠近時(shí)，FRET信號(hào)會(huì)被檢測(cè)到。通過(guò)檢測(cè)FRET信號(hào)，可以篩選出高產(chǎn)克隆。

3. 使用Cell Metric進(jìn)行成像以驗(yàn)證單克隆源性

使用Cell Metric高分辨率孔板成像系統(tǒng)進(jìn)行成像以驗(yàn)證單克隆源性。Cell Metric成像系統(tǒng)提供超高分辨率成像，達(dá)到2um/像素，能夠清晰展示細(xì)胞細(xì)節(jié)，確保成像質(zhì)量。激光對(duì)焦技術(shù)確保每個(gè)細(xì)胞孔都得到準(zhǔn)確成像，避免虛焦和遺漏微孔信息。

具體應(yīng)用如下：

- Day 0細(xì)胞成像：在Day 0時(shí)，使用Cell Metric®對(duì)細(xì)胞板進(jìn)行拍照，記錄每個(gè)孔的細(xì)胞狀態(tài)。

- Day 1和Day 2細(xì)胞成像：在Day 1和Day 2時(shí)，再次使用Cell Metric成像系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞板進(jìn)行拍照，記錄每個(gè)孔的細(xì)胞分裂情況。

- Day 7成像：在Day 7時(shí)，使用Cell Metric對(duì)細(xì)胞板進(jìn)行拍照，記錄每個(gè)孔的克隆形成情況。

通過(guò)Cell Metric成像，可以確認(rèn)約200-300個(gè)克隆有著高滴度值，并選擇至少50個(gè)滴度MAX高的單細(xì)胞擴(kuò)增克隆。這種單細(xì)胞克隆的確認(rèn)是非常嚴(yán)格的，并需要生成相關(guān)報(bào)告用于提交IND。

 4. 克隆擴(kuò)增

使用先前同樣的方法，從靜態(tài)培養(yǎng)到搖瓶培養(yǎng)進(jìn)行擴(kuò)增。另用一個(gè)30mL搖瓶補(bǔ)料分批培養(yǎng)，將高表達(dá)克隆繼續(xù)擴(kuò)增。

5. 克隆評(píng)價(jià)

基于細(xì)胞生長(zhǎng)和滴度測(cè)試來(lái)最終確定哪些克隆被送到生產(chǎn)部門，并還需要將細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行純化交到分析部門，進(jìn)行蛋白質(zhì)量檢測(cè)——CE-SDS（毛細(xì)管電泳-SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳），HPLC-SEC（高效液相-尺寸排阻色譜），CIEF（等電毛細(xì)聚焦），結(jié)合和功能測(cè)試。他們同樣要檢測(cè)拷貝數(shù)，檢測(cè)支原體。

 6. 產(chǎn)量分析

結(jié)果中挑選了8個(gè)產(chǎn)量高的克隆送去生產(chǎn)部門，進(jìn)行3L生物反應(yīng)器發(fā)酵，進(jìn)行活細(xì)胞密度（VCD）和IgG產(chǎn)量分析。

 7. 產(chǎn)生候選克隆

將品質(zhì)較高的候選克隆被挑選出來(lái)，創(chuàng)建研究細(xì)胞庫(kù)（RCB）。

通過(guò)Cell Metric高分辨率孔板成像系統(tǒng)，使FujiFilm Diosynth Biotechnologies公司能夠快速、高效地篩選出高產(chǎn)單細(xì)胞克隆，并保證其高概率和高單克隆源性。這種集成化平臺(tái)能夠縮短細(xì)胞系開發(fā)時(shí)間，并提供高通量、快速而溫和的細(xì)胞包裹、靈敏度高的定量分析、單細(xì)胞克隆衍生的視覺驗(yàn)證、高產(chǎn)單個(gè)細(xì)胞向微孔板中的自動(dòng)分配。

通過(guò)這個(gè)平臺(tái)，FujiFilm DDiosynth Biotechnologies公司能夠更有效地推動(dòng)其生物制藥研發(fā)進(jìn)程。Cell Metric®的高分辨率成像能力和對(duì)焦技術(shù)的精確性，使得科學(xué)家能夠從大量細(xì)胞中快速識(shí)別出單克隆細(xì)胞，從而節(jié)省了時(shí)間和資源。

Cell Metric細(xì)胞成像系統(tǒng)主要具有以下特點(diǎn)：

 1.實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和分析

Cell Metric配套軟件允許科學(xué)家實(shí)時(shí)監(jiān)控細(xì)胞在微池中的生長(zhǎng)情況，以及克隆的形成和生長(zhǎng)情況。這有助于及時(shí)發(fā)現(xiàn)和排除不表達(dá)的細(xì)胞微池，提高篩選的準(zhǔn)確性。同時(shí)，科學(xué)家可以利用軟件中的分析工具，對(duì)圖像進(jìn)行處理和分析，以獲得更多關(guān)于細(xì)胞生長(zhǎng)和克隆形成的信息。

2.自動(dòng)化的數(shù)據(jù)記錄和報(bào)告功能

Cell Metric細(xì)胞成像系統(tǒng)能夠自動(dòng)記錄每個(gè)孔的整孔成像，包括接種細(xì)胞的具體位置和細(xì)胞隨時(shí)間分裂和生長(zhǎng)的情況。這些數(shù)據(jù)可以被用于生成詳細(xì)的單克隆報(bào)告，記錄每個(gè)克隆的生長(zhǎng)情況，以及它們的產(chǎn)量和表達(dá)水平。這些報(bào)告對(duì)于提交給監(jiān)管機(jī)構(gòu)來(lái)說(shuō)是重要的，因?yàn)樗鼈冏C明了細(xì)胞系的單克隆源性。

3.高效篩選和驗(yàn)證

通過(guò)結(jié)合Cyto-Mine微流控單細(xì)胞分析篩選系統(tǒng)和Cell Metric高分辨率孔板成像系統(tǒng)，FujiFilm Diosynth Biotechnologies公司能夠?qū)崿F(xiàn)單細(xì)胞克隆的高效篩選和驗(yàn)證。這種集成化平臺(tái)能夠提供高通量、快速而溫和的細(xì)胞包裹、靈敏度高的定量分析、單細(xì)胞克隆衍生的視覺驗(yàn)證、高產(chǎn)單個(gè)細(xì)胞向微孔板中的自動(dòng)分配。

4.質(zhì)量控制和合規(guī)性

Cell Metric系統(tǒng)能夠直接生成單克隆報(bào)告，滿足政策法規(guī)中關(guān)于細(xì)胞單克隆源性的要求，并縮短篩選周期。高質(zhì)量成像結(jié)果可以作為證據(jù)文件提交給監(jiān)管部門，用以證明細(xì)胞系來(lái)源于單個(gè)細(xì)胞祖先。

    總的來(lái)說(shuō)，Cell Metric高分辨率孔板成像系統(tǒng)及一體化集成平臺(tái)不僅提高了篩選的速度，還確保了篩選的準(zhǔn)確性，成為生物制藥公司的新藥開發(fā)、抗體篩選等工藝生產(chǎn)的重要實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備。更多的實(shí)驗(yàn)室儀器、實(shí)驗(yàn)耗材、實(shí)驗(yàn)試劑可以進(jìn)入蘇州阿爾法生物